تبلیغات
مقالات مهندسی پزشکی ، برق ، الکترونیک ،علوم پایه ، علوم آزمایشگاهی ، پزشکی،روانشناسی - مطالب تجهیزات پزشکی

سل کانتر هماتولوژی - اتوآنالایزر-فلوسایتومتری-سل کانتر -اساس کار سل کانتر- کالیبراسیون سل کانتر-شمارنده سلولی - Cell Counter

1390/09/26 06:38

نویسنده : شهرام قاسمی
ارسال شده در: تجهیزات پزشکی ،

از این دستگاه برای اندازه‌گیری پارامترهای خونی به صورت كمی استفاده می‌كنند . وظیفه اصلی این دستگاه ها تهیه گزارش سریع و دقیق به روشی ساده از پارامترهای اصلی خون است ، به نحوی كه نمونه های غیر طبیعی یا بلاست از نمونه های طبیعی تفكیك گردیده و جهت انجام بررسی های بیشتر آنها از روش های متداول دیگر كمك گرفته می شود .


وظیفه اصلی این دستگاهها تهیه گزارش سریع و دقیق به روشی ساده از پارامتر‌های اصلی خون است، به نحوی که نمونه‌های غیر طبیعی از نمونه‌های طبیعی تفکیک گردیده و جهت انجام بررسی‌های بیشتر آنها از روش‌های متداول دیگر کمک گرفته می‌شود.سل کانتر از دو واژه سل (سلول) و کانت (شمارش) تشکیل شده است . استفاده از این دستگاه ها امروزه پیشرفت خوبی داشته است ولی بعد از 25 سال از تولید نسل جدید این دستگاه ها هنوز هیچ شرکتی نتوانسته است سیستمی مانند سیستم های شرکت سیسمکس را به بازار عرضه کند که توانایی اندازه گیری اندیکس های داخل گلبول های قرمز را دارند . روش دستی هم در کنار این روش اتوماتیک برای کالیبراسیون استفاده می شود . هر چند که این دستگاه ها یکی از ملزومات آزمایشگاه های امروزه هستند و با دقت بالا کار می کنند اما باز هم ممکن است جواب به دست آمده از نتایج واقعی دور باشد اما این عیب هم باعث عدم استفاده از این دستگاهها نمی شود . در کذشته سل کانتر ها بر اساس اندازه ، سلول ها را شمارش می کردند اما امروزه از روش های جدیدی مانند اسکاتر استفاده می شود . انواع مختلفی از این نوع دستگاهها وجود دارد که از روش های مختلفی برای اندازه گیری و شمارش سلول ها استفاده می شود اما تقریبا تمام آنها از یکی از چهار روش معرفی شده استفاده می کنند امپدانس (روش امپدانس الكتریكی-تغییر در هدایت الكتریكی) ، اپتیکال (الكترواپتیكال) ، سیتوشیمیکال و تلفیقی .


روش امپدانس به علت سهولت و مزایایی نسبتا خوبی که دارد بیشتر استفاده می شود .  سل کانتر های اپتیکال توسط نور و قوانین حاکم بر ان اندیکس های هماتولوژی را گزارش می کند .سیتوشیمی هم روشی است که به طور انحصاری در دستگاه های شرکت بایر استفاده می شود . شرکت های مختلف و با نام های تجاری گوناگون در سراسر جهان انواع این دستگاه ها را با متد های گوناگون به بازار عرضه می کنند از مهمترین انها می توان به شرکت های Sysmex ، Abbott ، ABX و ... اشاره کرد . در میان شرکت های فوق فقط دستگاه 25 ساله مربوط به شرکت سیمکس به نام H1 توانایی های بسیار قوی نسبت به سایر دستگاه ها دارد و به همین منوال هم سهم بیشتری از بازار را به خود جذب کرده است . 

  • در ادامه چهار روش مورد استفاده در سل کانتر ها را بررسی می کنیم :
  • 1. روش امپدانس :
    امپدانس الكتریكی عمده‌ترین روش به‌كار گرفته‌شده در تحلیل‌گرهای هماتولوژی است. در این روش سلولهای خونی (ذرات بیولوژیك نارسانا) در یك رقیق‌كننده هادی جریان الكتریكی (الكترولیت) معلق شده و سپس به داخل روزنه شمارش یك استوانه شیشه‌ای كشیده می‌شود. در محفظه شمارش یك جریان الكتریكی با فركانس پایین (حریان مستقیم)بین الكترودهای خارجی كه در دو طرف روزنه در الكترولیت معلق است، برقرار است. هنگامی‌ كه یك سلول خونی از منطقه حساس روزنه عبور می‌كند، باعث تغییر ولتاژ جریان الكتریكی شده و ایجاد یك پالس الكتریكی می‌نماید كه اندازه آن متناسب با حجم سلول است. سل‌كانترهایی كه براساس امپدانس الكتریكی عمل می‌كنند دارای دو كانال جهت شمارش سلولها است: - كانال شمارش اریتروسیت / پلاكت - كانال شمارش لكوسیت‌ها.

    2. روش‌های اپتیكال (نوری) 
    فن‌آوری الكترواپتیكال، صرف نظر از روش خاص بكار گرفته شده اساسا بر واكنش متقابل نور و ماده استوار است. هنگامی كه یك پرتو نوری به جسمی كه دارای ضریب شكست (دانسیته) خاصی است برخورد كند به چند حالت در می‌اید . منبع نوری به‌كار گرفته شده در دستگاه‌ها غالبا یك لامپ تنگستن-هالوژن یا یك لیزر نیمه هادی (نظیر لیزر نئون-هلیوم) است. در این فن‌آوری سوسپانسیون رقیق شده سلول‌های خونی به داخل جریان پیوسته‌ای از محلول الكترولیتی تزریق می‌شود. جریان پیوسته و غلافی شكل محلول الكترولیتی باعث هدایت و عبور سلول‌ها به صورت تك ردیفی (فلوسل) از كانال فلوسل (Flow cell) می‌شود. در این كانال سلول‌ها در محل خاصی از مقابل منبع نوری عبور كرده و مورد اصابت پرتوهای نوری قرار می‌گیرد. بسته به نور موجود و وضعیت سلول، نور اصابت كرده به سلول ممكن است جذب شود، برگشت پیدا كند (بازتابش)، در جهت‌های گوناگونی پراكنده شود و. . . . در این سل‌كانترها، آشكارسازهای نوری (فتودتكتورها) Photodetectors))خاصی جهت شناسایی و تبدیل پرتوهای پراكنده شده به سیگنال‌های الكتریكی، تعبیه شده‌ است .

    3. تحلیل‌گرهای تلفیقی (هیبرید)
    روش‌های امپدانسی و اپتیكال با وجود مزایای متعدد، هریك دارای محدودیت‌هایی است كه كارایی آنها را تحت تأثیر قرار می‌دهد. به منظور رفع این محدودیت‌ها و دستیابی به فن‌آوریهای برتر در شمارش سلولی، شركت‌های سازنده تحلیل‌گرهای هماتولوژی به‌ تدریج به سمت به‌كارگیری روش‌های تلفیقی روی آوردند كه این امر منجر به افزایش كارایی تحلیل‌گرها و نیز صحت پاسخ‌های حاصل از آنها شده است. از جمله این روش‌های تلفیقی می‌توان به روشهای RF/DC و VCS اشاره نمود .

برسی ساختمان و عملکرد دستگاه شمارش گر H1
همان طور که احتمالا متوجه شدید مدل H1 یکی از موفق ترین مدل های آنالیزور های هماتولوژی میباشد ما هم در ادامه این دستگاه را معرفی خواهیم کرد . 

ساختمان H1
الف ) واکنش سیتوشیمیایی یا آماده سازی
ب ) فلوسل : سنجش ابعاد
ج)کانورتر : تبدیل خرجوی دستگاه به اعداد

کانال های دستگاه H1
در این دستگاه چهار نوع کانال یا دریچه تعبیه شده است که هر کدام مربوط به عملکر خاصی هستند . 
کانال های شامل کانال های گلبول های قرمز ، پلاکت ، پراکسیداز و هموگلوبین است . باید توجه کرد که در سل کانتر ها ابتدا سه اندیکس هموگلوبین ، هماتوکریت و MCV به دست می آید و با استفاده از انها می توان سایر اندیکس ها را به دست اورد . سه کانال اولی از روش فلوسایتومتری استفاده می کنند ولی کانال آخری (هموگلوبین) از روش رنگ سنجی استفاده می کند . 

 کانال هموگلوبین 


روشی که برای اندازه گیری هموگلوبین در سل کانترها استفاده می شود همان روش سیان متهموگلوبین معمولی است که به صورت روتین در آزمایشگاه ها استفاده می شود اما همان طور که می دانید این روش به مدت زمان زیادی نیاز دارد . در دستگاه های سل کانتر برای کاهش این زمان از همین روش استفاده می شود ولی با مقداری تغییرات تا زمان آزمایش کاهش یابد . در سل کانتر 2 میکرولیتر خون با 500 میکرولیتر خون مخلوط شده و زمان نیز هم با کاهش مقادیر ، کاهش میابد . 

در این روش باید به یک نقطه توجه کرد آن هم این است که هم درون گلبول های قرمز و درون ساختارهای پورفرینی است بنابراین این هم برای انجام سریع واکنش باید خیلی سریع آزاد شود و در اختیار محلول کار قرار گیرد تا سیانومتهموگلوبین به دست آید . برای این کار از محلول "لوریل دی متیل آمین اکسید" استفاده می شود . این محلول گلبول های قرمز را مانند مکانیسم بادکندکی میترکاند و باعث کاهش زمان آزمایش به زیر 10 ثانیه می شود . 


بعد از مخلوط شدن هموگلوبین با محلول کار ، (به غیر از سولفو هموگلوبین) می توان در طول موج 540 نانومتر میزان هموگلوبین را توسط اسپکتوفوتومتر اندازه گیری کرد . 
بعد از اندازه گیری هموگلئبین می توان بر اساس فرمول های زیر میزان MCH و MCHC را به دست اورد که اولی میزان هموگلوبین متوسط در یک گلبول قرمز ولی دومی میزان هموگلوبین در حجم میعنی از گلبول های قرمز (مانند هماتوکریت فرد) است . 


MCH= Hg⁄(RBC Count)
MCHC= Hg⁄HCT


همان طور که توضیح دادیم میزان هموگلوبین در سل کانتر تقریبا مانند روش دستی آن است اما با دقت زیاد و با زمان بسیار کمتر انجام میگیرد . 
فلوسایتومتری روشی است که در دستگاه H1 برای اندازه گیری RBC , PT , PO استفاده می شود . این روش دارای دقت بسیار زیادی است که در ادامه بحث می شود . 




فلوسایتومتری

  •  تعریف : تکنیک مطالعه مشخصات ریز سلول ها است هنگامی که سلول ها یکی پس از دیگری به صورت معلق در مایع سیال به همراه مایع غلیظ تری به نام Sheath از نقطه حساس نوری در داخل سلول می گذرند . کار این مایع غلیظ این است که باعث می شود سلول ها یکی یکی از روبه روی نور عبور کنند .

فلوسایتومتری


تاریخچه مختصر
فلوسایتو متری تکنیکی است با کارآیی بالا که برای اولین بار توسط Wolfgang Göhde در سال 1968 در دانشگاه مونستر کشف شد .نام اولیه این روش "pulse cytophotometry" بود که در کنفرانس 1988 در امریکا به فلوسایتومتری تبدیل شد . 


 مقدمه تکنیک 
 فلوسیتومتری به طور کلی روشی برای شمارش ذرات و بررسی میکروسکوپی ، مانند سلول ها و کروموزوم ها است . در این حالت ذره در یک جریان سیال تعلیق شده و ذره یکی به یکی از مقابل نور عبور میکند و شمارش انجام می شود . همچنین این دستگاه اجازه بررسی multiparametric پارامتر های فیزیکی و شیمیایی را در یک زمان بسیار اندک را می دهد . فلوسیتومتری به طور مداوم در تشخیص اختلالات استفاده می شود ، به خصوص سرطان خون ، اما بسیاری از برنامه های کاربردی دیگر در هر دو پژوهش بالینی و عمل هم شامل ان می شوند . 

 نحوه کار دستگاه
پرتویی از طول موج معین (معمولا نور لیزر ) بر ذرات موجود در یک ماده هیدرودینامیکال تابانده و فوکس می شود . در این قسمت باید استکر را تعریف کرد اصطلاحا :
"به نوری که از درون جسم عبور می کند و از ان ساطع می شود را گویند "
تعدادی دتکتور و یا آشکار ساز در درون دستگاه و در نقطه عبور نور تعبیه شده است . یکی از انها در مقابل و هم خط پرتو نوری است (Forward Scatter or FSC) و دیگری اسکتر جانبی است که به صورت عمود نسبت به منبع نور قرار دارد علاوه بر این ها تعدادی دتکتور فلورسانس دیگری هم در دستگاه تعبیه شده است . اندازه ذرات عبوری از مقابل نور ، 0.2 تا 150 میکرومتر است و اگر ذره ای که دارای ماده شیمیایی فلوروسنت است و یا ماده ای فلوروسنتی است که به ذره متصل شده است ، نور تغییر طول خواهد داد . ترکیب اسکتر و فلوروسنت باعث ایجاد نور مرئی در دتکتور خواهد شد . با برسی میزان درخشندگی و ورش های کامپیوتری میتواند نوع سلول ها و مواد شیمیایی آن ها را برسی کرد . 

 سه اصل مهم در فلوسایتو متری 
الف ) یکنواخت بودن جریان عبور سلول ها 
ب ) یکنواخت بودن غلظت سیال و محلول شیذ
ج ) یکنواخت بودن فشار مکش و ترزیق ذرات


 ساختمان فلوسایتومتر
به طور کلی این دستگاه از 5 قسمت تشکیل می شود :
 جریان مایع یا محلول sheath : کار این مایع غلیظ این است که فلوسل ها به صورت یکی به یکی از مقابل نور عبور می کنند 
 سیستم نوری : معمولا از لامپهای جیوه – زنون استفاده می شود . سایر لیزر ها (دیودی – آرگون – کیریپتون – UV و .. ) هم بنابه نیاز و یا سیستم دستگاه استفاده می شوند . 
 ردیاب (ADC): تبدیل اندیکس های آنالوگی به دیجیتال را انجام می دهد . حالت های اسکتر و آنالیز و تولید زبان دیجیتالی از داده ها توسط این بخش انجام می شود . 
 تقویت کننده سیستم (آمپلیفایر)
 کامپیوتر: برای تجزیه و تحلیل سیگنال
فرایند جمع آوری داده ها توسط فلوسایتومتر " Acquisition " نامیده می شود . Acquisition با اتصال یک کامپیوتر به دستگاه و نرم افزار مربوطه آن انجام می شود . با استفاده از نرافزار می توان پارامتر های مربوط به نوع ذره را تغغیر داد (مانند ولتاژ) . 
دستگاهی که ما برسی کردیم جز حداقلها بود به طوری که امروزه دستگاه های با برند های مختلف وارد بازار شده اند که دارای 4 لیزر و 18 دتکتور فلوروسنت می باشند .

نحوه کار دستگاه فلوسایتومتر

مقادیر قابل اندازه گیری توسط فلوسایتو متری در هماتولوژی
 حجم و مورفولوژی RBC
 رنگدانه های سلول
 چرخه DNA , RNA
 تغییرات پروتئین ها 
 برسی CD مارکر های – به ویژه در لوسمی و بیماری های لوکوسیتی
 آنتی ژن های داخل سلولی وحتی هسته ای
 الکترولیت های و PH داخل سلولی
 سیالیت غشا

بعد از اشنایی مختصر با فلوسایتومتری به ادامه بحث خود می پردازیم . در دستگاه H1 اندازه گیری سه کانال باقی مانده یعنی RBC , Pt ,Proxidas توسط روش فلوسایتومتری انجام می شود . 


 کانال RBC – Pt
برای اندازه گیری اندیکس ها از روش Novel استفاده می کنیم که گلبول ها را به صورت ایزولومتریک در میاورد . یعنی تغییری در حجم فلوسل انجام نمی گیرد ولی شکل سلول تغییر می کند . 
باید توجه کرد که :
"گلبول های حاوی HgS در این دستگاه قابل شناسایی نیستند چون این سلول ها به صورت برگشت ناپذیری به حالت داسی شکل تبدیل شده اند "
بعد از عبور فلوسل مورد نظر از جلوی نور (در اینجا گلبول قرمز و یا پلاکت) مقادیر تحت شرایط زیر به دست خواهد آمد : 
 اسکتر در زاویه 2-3 درجه به عنوان حجم
 اسکتر در زاویه 5-15 درجه به عنوان هموگلوبین (مقدار هموگلوبین از این روش هم به دست می آید)
بعد داریم : 
HCT=RBC .c ×MCV
لازم به ذکر این نقطه است که زاویه در پلاکت 30-39درجه است .
همانطور که در آغاز هم گفته شد با دست آوردن سه واحد اصلی مورد نظر ما سایر اعداد و اندیکس ها به دست خواهند آمد . بنابراین به گزارش اندیکس های هموگلوبین (دو روش) و هماتوکریت (با فرمول همین صفحه) و متوسط حجم سلولی (توسط فلوسایتو متر) می تواند سایر اندیسک های مهم را گزارش داد . 

کانال پراکسیداز از این کانال برای برسی گرانول های سیاه موجود در لوکسیت ها استفاده می شود که توسط آنزیم پراکسیداز تولید می شود . برای شناسایی این گرانول ها باید این اجسام توسط رنگ امیزی آشکار شوند . رنگ آمیزی مورد استفاده در این روش رنگ آمیزی "هیدرو پراکسیداز" است که باعث رنگ امیزی گرانول ها به قهوه ای (رنگ ضعیف) و سیاه (رنگ قوی) می شود . 

 روش رنگ آمیزی هیدروپراکسیداز
گلبول های قرمز در حرارت 75 درجه سانتی گراد به طور کامل لیز می شوند تا لوکوسیت ها تنها در نمونه ما باقی بمانند . بعد از این کاری رنگ امیزی شروع می شود . گرانول ها پر اکسیداز دارای انزیم کاتالاز هستند و این انزیم با سوربیتول واکنش می دهد . پس واکنش اولیه ما :
فرم آلدهید + سوربیتول 
ترکیب دو ماده را بر روی لوکوسیت ها قرار می دهیم سپس در ادامه :
آب اکسیژنه + 4 فنول و 1 نفتول = تولید رنگ سیاه
اگر انزیم در گرانول وجود داشته باشد باعث تولید رنگ خواهد شد . 
مانند کانال RBC اسکتر در زاویه 2 درجه حجم و اسکتر در زاویه 5 – 15 درجه میزان انزیم پراکسیداز است . 
 نکته : نتیجه پراکسیداز به صورت دسته جمعی گزارش می شود . 

 سایر کانال ها
در کانال بازوفیل هم تعدا لوبوله شدن و سیگمانته ها لوکوسیت ها برسی می شود . برای این کار ابتدا گلبول های قرمز را لیز می کنیم . بعد از اینکه سلول ها را لخت کردیم (برای آشکار سازی هسته و سلول های بازوفیل لخت نمی شوند) هسته انها آشکار شده و توسط قانون های فلوسایتومتر تعدا لوبول های هسته و یا حالت دانسیته آنها مشخص و گزارش می شود .

آنالایزرهای هماتولوژی به روش امپدانس الکتریکی
آنالایزرهای هماتولوژی یا سل کانترها ، دستگاه های تمام اتوماتیکی هستند که برای اندازه گیری کمی پارامترهای خون در آزمایشگاه های پزشکی مورد استفاده قرار می گیرند . وظیفه اصلی این دستگاه ها تهیه گزارش سریع و دقیق به روشی ساده از پارامترهای اصلی خون است ، به نحوی که نمونه های غیر طبیعی از نمونه های طبیعی تفکیک گردیده و جهت انجام بررسی های بیشتر آنها از روش های متداول دیگر کمک گرفته می شود .

اجزای اصلی سل کانتر
سل کانترها معمولا از سه بخش اصلی هیدرولیک ، پنوماتیک و الکترونیکی تشکیل می گردند .

وظایف سیستم هیدرولیک
وظایف سیستم هیدرولیک شامل برداشت محصول های مورد نیاز دستگاه و نمونه خون یا Aspirating ، تخلیه
محلول ها یا خون برداشت شده یا Diapensing ، رقیق سازی نمونه یا Diluting، مخلوط کردن نمونه و محلول ها یا Mixing و افزایش محلول لیز کننده یا Lysing است .

وظایف سیستم پنوماتیک
وظیفه اصلی سیستم پنوماتیک تولید خلاء یا فشار ثابت جهت کنترل دریچه ها و همچنین کنترل حرکت محلول ها و نمونه در داخل سیستم هیدولیک است .

وظایف سیستم الکترونیکی
این سیستم توسط یک ریز پردازنده ( میکروپروسسور ) کنترل می شود و وظایف زیر را به عهده دارد :
1 ) اندازه گیری وپردازش سیگنال های حاصل از تغییر امپدانس
2 ) محاسبه و انتقال نتایج به چاپگر یا هر خروجی دلخواه در سیستم
3 ) ترسیم گراف پارامترهای اصلی
4 ) کنترل زمان اندازه گیری و توالی تست ها
5 ) اجرای برنامه Q.C و کالیبراسیون سیستم
6 ) ذخیره و بازیابی ( Save and Load ) نتایج

محلول ها و مواد مورد نیاز در دستگاه سل کانتر
الف ) محلول ایزوتون یا Diluent : برای رقیق کردن خون از یک محلول ایزوتونیک که می تواند محیطی شبیه پلاسمای خون را تأمین نماید ، استفاده می شود . بدین ترتیب که یک رسانای مناسب جهت شمارش سلول های خونی ایجاد می گردد .
ب ) محلول لیز کننده یا Lyse از این محلول برای از بین بردن غشای سلول های قرمز در کاپیلاری مخصوص شمارش WBC استفاده می شود ، بدین ترتیب تداخل اندازه بین سلول های قرمز و سفید در شمارش آنها از بین می رود . همچنین از جذب نوری مخلوطی که از لایزوهموگلوبین تشکیل گردیده است ، برای اندازه گیری غلظت هموگلوبین استفاده می شود .
ج ) محلول شستشو یا Rinse : محلول شستشو نوعی دترجنت است که برای شستشوی تیوب ها و کاپیلاری ها و مرطوب نگه داشتن آنها پس از هر سیکل اندازه گیری مورد استفاده قرار می گیرد .
د ) محلول شستشوی آنزیماتیک یا E – Z Cleanser : یک محلول
آنزیمی مخصوص است که برای پاک کردن بهتر تیوب ها وکاپیلاری به صورت روزانه مورد استفاده قرار می گیرد ( قبل از خاموش کردن دستگاه ) و ضرری برای قسمت های پلاستیکی دستگاه ندارد .
ه ) محلول پاک کننده پروب ها یا Probe Cleanser : از این محلول برای پاک کردن و حل کردن لخته خون های به جای مانده در پروب ها و تیوب ها و کاپیلاری دستگاه استفاده می شود و معمولا این محلول باید 15 دقیقه در این مسیرها قرار گیرد تا مؤثر واقع شود .
و ) کالیبراتور : یک محصول خنوی با پارامترها و مقادیر مشخص و ثابت است که به صورت تجارتی و مطابق با استانداردهای مرجع پزشکی تولید می شود و از آن برای کالیبره کردن دستگاه سل کانتر استفاده می شود .
ز ) کنترل : یک محصول خونی با پارامترها و مقادیر مشخص وثابت است که به صورت تجارتی در سه نوع Low ، Normal و High تولید می شود . خون کنترل باید روزانه برای چک کردن عملکرد دستگاه سل کانتر مورد استفاده قرار گیرد .

اصول شمارش سلول های خونی
نمونه رقیق شده مورد اندازه گیری توسط یک فشار منفی به داخل روزنه WBC و RBC مکش می شود . در سیستم اندازه گیری ، یک لوله شیشه ای دقیق که لوله اندازه گیری نامیده می شود ، وجود دارد که وظیفه آن کنترل ثابت بودن حجم نمونه مورد اندازه گیری در طول یک سیکل شمارش است . در بالا و پایین این لوله اندازه گیری دو سنسور نوری قرار داده شده که فاصله بین این دو سنسور ، حجم نمونه مورد اندازه گیری را مشخص می نماید و از آنجایی که این فاصله همیشه ثابت است ، حجم های اندازه گیری شده در دیسک های مختلف شمارش نیز ثابت است .
سلول های سفید خون ( WBC ) ، سلول های قرمز خون ( RBC ) و پلاکت ها به روش امپدانس الکتریکی شمارش شده و سایز بندی می شوند . این روش بر اساس اندازه گیری تغییرات در مقاومت الکتریکی بین دو الکترود مثبت و منفی پایه گذاری شده است . شایان ذکر است که تغییرات در مقاومت الکتریکی بین دو الکترود ، ناشی از عبور ذرات و سلول های خونی با اندازه های مختلف از روزنه بین الکترودهای مثبت و منفی است . الکترودها در زیر سطح محلول در دو طرف یک روزنه که Aperture نامیده می شود ، قرار داده شده اند و تشکیل یک مسیر الکتریکی را می دهند .
سلول های خونی دارای اندازه های مختلفی هستند . بر اساس این اندازه ها ، هر سلول که از درون روزنه عبور نماید موجب افزایش امپدانس الکتریکی بین دو الکترود می شود . بدین ترتیب می توان امپدانس های ایجاد شده را به سلول های مشخص نسبت داد .
دستگاه سل کانتر سلول های خونی را به تنهایی شمارش و بر اساس اندازه دسته بندی می نماید . حجم مشخصی از نمونه رقیق شده آماده قرائت از روزنه 70 میکرومتری RBC و نیز از روزنه 100 میکرومتری WBC عبور نموده و شمارش انجام می گیرد . همچنین یک سیستم نوری برای قرائت هموگلوبین در دستگاه سل کانتر طراحی شده است . این سیستم دارای دو سنسور نوری است . وقتی محلول آماده شمارش از سنسور بالایی عبور می نماید ، سیکل شمارش آغاز می گردد و با عبور از مقابل سنسور پایینی این سیکل خاتمه می یابد ، لذا در کلیه سیکل های شمارش حجم ثابت و مشخصی از محلول آماده شمارش می شود . بنابراین اگر یک حباب و یا یک لخته خون در محلول آماده وجود داشته باشد ، سیستم سریعا اخطار می دهد و اپراتور متوجه خطا در شمارش می گردد .

سیستم نوری جهت اندازه گیری و ثبت حجم اندازه گیری

DILUTION
در خون کامل سلول ها بسیار نزدیک به یکدیگر هستند ، بنابراین برای جداسازی و روان سازی آن باید از یک محلول رقیق ساز ایزوتونیک استفاده کنیم . در سل کانترهایی که به روش امپدانس الکتریکی کار می کنند ، به دو روش می توان سیکل اندازه گیری را آغاز نمود :روش اندازه گیری خون کامل و روش اندازه گیری خون رقیق شده.

روش اندازه گیری خون کامل
در این روش 13 میکرولیتر از خون کامل توسط دستگاه مکش می شود ، سپس با 5/3 میلی لیتر محلول ایزوتون رقیق می گردد ( 269 : 1 نسبت رقیق سازی اولیه ) . سپس این محلول رقیق شده اولیه به دو قسمت تقسیم
می گردد :
الف ) 6/15 میکرولیتر از محلول رقیق شده اولیه مکش می شود و با 6/2 میلی لیتر محلول ایزوتون مجددا رقیق می گردد ( رقیق سازی ثانویه 44833 : 1 ) . این محلول برای شمارش سلول های قرمز خون ( RBC) و پلاکت ها ( PLT ) مورد استفاده قرار می گیرد .
ب ) بقیه محلول رقیق شده با نیم میلی لیتر محلول لایز ترکیب می شود ( نسبت رقیق سازی ثانویه 308 : 1 ) . این محلول برای شمارش سلول های سفید ( WBC ) و اندازه گیری غلظت HGB مورد استفاده قرار می گیرد .
روش اندازه گیری خون رقیق شده
در این روش اپراتور ابتدا 20 میکرولیتر از خون کامل را با 6/1 میلی لیتر محلول ایزوتون رقیق می سازد ( نسبت
رقیق سازی خارجی 80 : 1 ) ، سپس 7/0 میلی لیتر از محلول رقیق شده خارجی توسط دستگاه مکش می شود و مجددا با 5/2 میلی لیتر محلول ایزوتون رقیق می گردد ( نسبت رقیق سازی اولیه در داخل دستگاه 366 : 1 ) ، سپس این محلول رقیق شده اولیه به دو قسمت زیر تقسیم می گردد:
الف ) 8/24 میکرولیتر از محلول رقیق شده اولیه مکش شده و مجددا با 3 میلی لیتر محلول ایزوتون رقیق
می گردد ( نسبت رقیق سازی ثانویه 44274 : 1 ) . این محلول برای شمارش های RBC و PLT مورد استفاده قرار می گیرد .
ب ) بقیه محلول رقیق شده اولیه با 36/0 میلی لیتر محلول لایز ترکیب شده و برای شمارش WBC و اندازه گیری غلظت HGB مورد استفاده قرا می گیرد ( نسبت رقیق سازی ثانویه 366 : 1 ) .

هنگامی که سلول های خون از روزنه مخصوص شمارش عبور می نمایند ، به طور لحظه ای تغییراتی در امپدانس و الکترود مثبت و منفی دو طرف روزنه ایجاد می شود و چون این تغییر امپدانس ارتباط مستقیمی با اندازه سلول عبور کرده دارد ، می توان امپدانس های ایجاد شده را به نوع سلول ارتباط داد .
در دستگاه سل کانتر ، امپدانس های تغییر یافته تقویت می شوند.



لینک منابع :در تصاویر های درج شده در مقاله موجود می باشد




دیدگاه ها : نظرات
برچسب ها: سل کانتر هماتولوژی - اتوآنالایزر-فلوسایتومتری-سل کانتر -اساس کار سل کانتر- کالیبراسیون سل کانتر-شمارنده سلولی - Cell Counter ، طرز کار سل کانتر ، طرز کار اتوآنالایزر هماتولوژی ،
آخرین ویرایش: 1390/09/26 06:49

فلوسیتومتری-فلوسایتومتری-اساس کار فلوسایتومتری-روش های فلوسایتومتری-کالبراسیون فلوسایتومتری-تکنولوژی فلوسیتومتری-دستگاه فلوسیتومتری

1390/09/20 07:03

نویسنده : شهرام قاسمی
ارسال شده در: تجهیزات پزشکی ،

فلوسیتومتری (به صورت مخخف FCM)  تکنیکی برای شمارش و بررسی ذرات میکروسوپی مانند کروموزم ها و سلول ها هست که با تعلیق آنها در یک جریان مایع و عبور دادن انها از مقابل یک دستگاه شناسایی الکترونیکی ، کار می کند .

فلوسیتومتری اجازه تجزیه و تحلیل هزار ذره را در هر ثانیه از  نظر چندین پارامتر فیزیک و یا شیمیایی را می دهد . این روش به طور معمول برای شناسایی ناهنجاری سلامتی به ویژه سرطان خون استفاده می شود اما این تکنیک استفاده گسترده دیگری هم در زمینه پژوهش و بالینی دارد . ویژگی مشترک ها این است که  ذرات را بر اساس خاصیت فیزیکی آنها دسته بندی می کنند و بدین صورت میتوانیم به جمعیت خالص خود دست یابیم .

 

                           | تاریخ فلوسیتومتری

نوعی فلوسیتومتر اولیه

 اولین دستگاه فلوسیتومتری بر اساس امپدانس با استفاده ازاصل کولتر در آمریکا رونمائی شد (حدود 1953 میلادی). اولین فلورسانس براساس دستگاه فلوسیتومتری در سال 1968 توسط ولفگانگ (Wolfgang Göhde) از دانشگاه مونستر و اولین استفاده تجاری از ان توسط یک شرکت آلمانی در سال های 1968/69 انجام گرفت . در آن زمان ، استفاده از روش های جذب به طور گسترده مورد علاقه دانشمندان بود و هنوز فلوسیتومتری رواج پیدا نکرده بود . بلافاصله بعد از آن ،تکنیک و ابزرات فلوسیتومتری گسترش یافتند . شامل تولید Cytofluorograph در سال 1971 ، Pas8000 در سال 1973 توسط شرکت Partec  ، اولین دستگاه FACS توسط شرکت  Becton Dickinson در سال 1974 و ...

 

نام تکنولوژی فلوسیتومتری

نام اصلی تکنیک فلوسیتومتری "پالس سیتوفتومتری" (آلمانی : Impulszytophotometrie) بود . درست بیست و دو  سال پیش یعنی در سال 1988 ،در کنفراسن مجمع مهندسان آمریکا در شهر فلوریدا ، نام آن به "فلوسیتومتری " تغییر یافت و به این صورت گسترش یافت .

 

اصل فلوسیتومتری

باریکه ای از نور(معمولا نور لیزر) تنها از یک طول موج به جریان مایع هیدرودینامیکی فوکس شده تابانده می شود . تعدادی آشکارسازدر نقاطی که جریان از برابر باریکه نور عبور می کند تعبیه شده اند : یکی از آنها در یک خط با پرتو نور (اسکاتر فوروارد یا پیش برنده FSC) و تعدادی دیگرهم عمود بر آن (اسکاتر کناری SSC) قرار دارند همچنین تعدادی آشکار ساز فلورسنت هم در دستگاه تعبیه شده است . هر یک از ذرات معلق از 0.2 تا 150 میکرومتر از برابر پرتو لیزر عبور می کنند و نور را پراکنده می کنند و مواد شیمیایی فلورسنت در ذرات و یا متصل شده به ذرات تهیج میشوند و نوری با طول موج بالا نسبت به منبع ساطع می کنند ترکیب نور اسکترها و فلورسنت توسط دکتورها انجام میگرید این روش بررسی ساختمان فیزیکی و شیمیایی و همچنین کسب اطلاعات مختلف از هر گونه ذره را ممکن می سازد . FSC یا اسکاتر مقابل (فوروارد اسکتر) با اندازه سلول و SSC با پیچیدگی درونی ذره (مانند شکل هسته ، تعداد و شکل گرانول های داخل سیتوپلاسمی ، زبری غشا ) متناسب است . برخی از دستگاه های فلوسیتومتری در بازار نور فلورسنت را حذف کرده اند و تنها از نور اسکاتر ها استفاده می کنند .

فلوسیتومتر

 مشاهده در اندازه بزرگ

 

فلوسیتومتر

فلوسیتومترهای امروزی قادرند تا هزار ذره را در یک ثانیه بررسی کنند که به انها "Real time" میگویند . این دستگاه ها میتوانند ذرات را بر اساس ویژگی های خاص ایزوله و آنالیز کنند . یک دستگاه فلوسیتومتری شبیه میکروسکوپ است به این تفاوت که به جای تولید یک تصویر از سلول ، دارای توانایی عملکردی بسیار بالا است و خودکار بر اساس پارامتر ها سلول ها را شمارش می کند . برای تجزیه و تحلیل بافت جامد باید سوسپانسیونی تک سلولی از بافت تهیه کنیم .

 

دستگاه فلوسیتومتری دارای 5 جزء اصلی است :

جریان سلولی (flow cell) : جریان مایع (مایع شیث)، که سلول های نمونه را حمل و صف بندی می کند تا یکی یکی از مقابل پرتو نور لیزر عبور کنند .

سیستم اندازه گیری : به طور معمول برای اندازه گیر امپدانس مورد استفاده قرار می گیرد .

سیستم نوری : لامپ (جیوه یا زنون) ، لیزر خنک کننده آبی با قدرت زیاد (لیزری که توسط سیستم ابی خنک می شوند) (آرگون ، کریپتون ، لیزر رنگی) ، لیزر خنک کننده آبی با قدرت کم (آرگون 488 نانومتر)، لیزر  قرمزHeNe (633 نانومتر) ، سبز HeNe، لیزر HeCd (اشعه ماورای بنفش UV)   ، لیزر دیودی (آبی ، سبز ، قرمز ، بنفش) جز سیستم نوری فلوسیتومترهستند که در سیگنال نوری تکنیک کاربرد دارند .

سیستم ADC (تبدیل کننده سیستم آنالوگ به دیجیتال) که سیگنال های نوری  اسکترهای جلو و پهلویی و همچنین سیگنال های فلورسنت را به سیگنال های الکترونیکی که قابل شناسایی با کامپیوتر هستند ،  تبدیل میکند .

سیستم تقویت کننده خطی یا لگاریتمی

 

رایانه برای آنالیز سیگنال ها 

فرایند  جمع آوری اطلاعات از نمونه در دستگاه فلوسیتومتر به مرحله "'Acquisition'" یا تحصیل معروف است . فرایند تحصیل به کمک رایانه ای انجام می گیرد که به طور فیزیکی به دستگاه وصل شده است و نرم افزاری که واسطه دیجیتالی بین کامپیوتر و کاربر است . این نرم افزار قابلیت تنظیم پارامترها بر اساس نوع نمونه را دارد (مانند ولتاژ ) . همچنین نرم افزار کمک می کند تا به اطلاعات اولیه نمونه دسترسی داشته باشیم و بدین وسیله از صحت تنظیم پارامترها اطلاع یابیم . دستگاه های فلوسیتومتری اولیه به طور کلی ، دستگاه های تجربی بودند اما پیشرفت های تکنیکی برنامه های کابردی وسیعی را ایجاد کرده است که در هر دو زمینه بالینی و پژوهشی به طور گسترده استفاده می شود . با توجه به این تحولات ، بازار ابزارت ، نرم افزارهای تجزیه و تحلیل وهمچنین ریجنت ها (معرف ها) مانند آنتی بادی های فلورسنت شده به طور چشم گیری گسترش یافته است .

 

آنالیز اطلاعات

Gating

اطلعات جمع اوری شده توسط فلوسیتومتر را میتوان در بُعد واحدی و یا در دو بعد و یا حتی سه بعد برای تولید یک هیستوگرام رسم نمود . مناطقی از این هیستوگرام را میتوان به صورت مرتب بر اساس شدت فلورسنت از هم جدا کرد . این کار با استفاده از "واحد های استخراجی" انجام میگیرد که به آنها "گیت" می گیوند . پروتکل های اختصاصی Gatting برای شناسایی بیماری ها و همچنین اهداف کلینیک و آزمایشگاهی به خصوص در خون شناسی تعریف و ایجاد شده است .

رسم ها معمولا در مقیاس های لگارتیمی ساخته می شوند. از انجا که طیف رنگ های فلورسنت با هم ، همپوشانی دارند سیگنال ها در دتکتورها (آشکارسازها) باید از نظر الکتریکی و محاسباتی جدا شوند . داده های گردآوری شده با فلوسیتومتری توسط نرم افزار های مختلفی مانند WinMD (توصیه نمی شود) ، Flowjo ، Cell quest Pro بررسی می شوند . بعد از اینکه داده ها جمع آوری شدند دیگر نیاز به اتصال دستگاه فلوسیتومتری نیست . به همین دلیل است که بررسی ها معمولا در رایانه جداگانه ای انجام میگیرد . این کار به ویژه در مراکزی که با تقاضای بالا استفاده از دستگاه روبه رو هستند لازم است .

نرم افزار فلوسیتومتر

 

تجزیه و تحلیل محاسباتی | Computational analysis

پیشرفت های اخیر در شناسایی خودکار که بر اساس روشهای محاسباتی انجام میگرید ارئه کننده جایگزینی  برای استراژی های gate است . سیستم های خودکار شناسایی به طور بالقوه جمعیت های پنهان و نادر را شناسایی می کنند با ادامه مطلب در چند روز آینده همراه ما باشید .




دیدگاه ها : نظرات
برچسب ها: فلوسیتومتری-فلوسایتومتری-اساس کار فلوسایتومتری-روش های فلوسایتومتری-کالبراسیون فلوسایتومتری-تکنولوژی فلوسیتومتری-دستگاه فلوسیتومتری ،
آخرین ویرایش: 1390/09/26 08:52

لطفا مطالعه کنید

1390/08/30 21:57

نویسنده : شهرام قاسمی
ارسال شده در: کمک های اولیه و اورژانسی ، تجهیزات پزشکی ، مقالات علمی آموزشی ، مقالات آموزش سخت افزار ، آموزش تعمیرات کامپیوتر ، آموزش شبکه ، ترفندهای کامپیوتری ، امنیت وشبکه ، اختراعات ، الکترونیک ، روباتیک ، پزشکی ، دارو شناسی ، ورزش و تغذیه ، گیاه شناسی ، روانشناسی ، مد و زندگی ، روش های موفقیت ، داروهای موضوعی ، دارو های گیاهی ، کمک های اولیه ، بارداری و بچه داری ، دانستنیهای پزشکی ، ازدواج و خانواده ، پوست ، مو ، زیبایی ، مهارت های زندگی ، مسائل جنسی در خانواده ، خصوصیات اقلیمی گیاهان ، روشهای مطالعه صحیح ، دل نوشت ،



دیدگاه ها : نظرات
آخرین ویرایش: 1390/11/8 09:09

کروماتوگرافی

1390/08/30 11:40

نویسنده : شهرام قاسمی
ارسال شده در: مقالات علمی آموزشی ، تجهیزات پزشکی ،
کروماتوگرافی راهی است برای تشخیص اجزا در ابعاد نانومتری، با دقتی در حد و اندازة مولکولی و مدتها پیش از شکلگیری فناوری نانو، برای شناسایی مواد به کار میرفت. اگر چند مولکول با هم داشته باشیم، کروماتوگرافی تشخیص میدهد غلظت آنها چقدر است. اساس کار کروماتوگرافی جداسازی اجزای مخلوط با استفاده از سرعت متفاوت حرکت مولکولهای مختلف در محیط یکسان و با انرژی اولیة مشابه است. دستگاههای کروماتوگرافی پیشرفته، میلیونها مولکول مختلف را در یک میلیمتر مخلوط بهراحتی شناسایی میکنند و پژوهشگران فناوری نانو میتوانند به کمک این روشها قسمت عمدهای از مشکلات خود را در شناسایی مواد مورد استفاده رفع کنند.
کروماتوگرافی به عنوان یکی از روشهای آزمایشیِ کارآمد در نانو فناوری، شامل چند روش است: کروماتوگرافی کاغذی، کروماتوگرافی ژلی و کروماتوگرافی گازی از جمله روشهایی هستند که در اینجا با آنها آشنا میشویم. دقت کنید که زمان، عامل کنترل ما بر انتخاب ذراتی است که با سرعتهای مختلف در محیط کروماتوگرافی توزیع مکانی مییابند.
ریشة لغویِ کروماتوگرافی
در زبان یونانی chroma به معنی رنگ و grophein به معنی نوشتن است.
اطلاعات اولیه
کروماتوگرافی پُرکاربردترین شیوة جداسازی تجزیهای است که در تمام شاخههای علوم به کار میرود. کروماتوگرافی گروه گوناگون و مهمی از روشهای جداسازی را شامل میشود و امکان میدهد تا اجزای سازندة نزدیک به همِ مخلوطهای کمپلکس را جدا، منزوی و شناسایی کند. بسیاری از این جداسازیها به روشهای دیگر ناممکن است.
سیر تحولی رشد
اولین روشهای کروماتوگرافی در سال 1903 توسط میخائیل سوئت ابداع و نامگذاری شد. او از این روش برای جداسازی مواد رنگی استفاده کرد.ریچارد لارنس و جان آرچر در سال 1952 به پاس اکتشافاتشان در زمینة کروماتوگرافی جایزة نوبل گرفتند.
توصیف کروماتوگرافی
کروماتوگرافی را به علت اینکه دربرگیرندة سیستمها و تکنیکهای مختلفی است نمیتوان به طور مشخص تعریف کرد. اغلب جداسازیها بر مبنای کروماتوگرافی و بر روی مخلوطهایی از مواد بیرنگ از جمله گازها صورت میگیرد.
کروماتوگرافی متکی بر حرکت نسبی دو فاز است. یکی از این فازها بدون حرکت است و فاز ساکن نامیده میشود و دیگری را فاز متحرک مینامند. اجزای یک مخلوط به وسیلة جریانی از یک فاز متحرک از داخل فاز ساکن عبور داده میشوند و جداسازی بر اختلاف در سرعت مهاجرت اجزای مختلف نمونه استواراست.
مثال
اگر به طور ساده بخواهیم عمل کروماتوگرافی را انجام دهیم، یک لیوان حاوی آب را برمیداریم و یک قطره جوهر در آن میچکانیم. سپس تکهکاغذی را برمیداریم و قسمتی از آن را در لیوان آب قرار میدهیم. پس از مدتی مشاهده میشود که جوهر از کاغذ بالا میرود و پخش میشود.


برای مشاهده شبیه سازی کروماتوگرافی کلیک کنید
روشهای کروماتوگرافی
روشهای کروماتوگرافی، بر حسب ماهیت فاز متحرک و سپس بر حسب ماهیت فاز ساکن، ممکن است جامد، مایع و گاز باشند. بدین ترتیب، فرآیند کروماتوگرافی به چهار بخش اصلی تقسیم میشود. باید گفت که اگر فاز ساکن، مایع باشد کروماتوگرافی را تقسیمی مینامند.
انواع کروماتوگرافی
هر یک از 4 نوع اصلی کروماتوگرافی انواع مختلفی دارد:
کروماتوگرافی مایع ـ جامد
• کروماتوگرافی جذب سطحی
• کروماتوگرافی لایة نازک
• کروماتوگرافی تبادل یونی
• کروماتوگرافی ژلی
کروماتوگرافی گاز ـ جامد
کروماتوگرافی مایع ـ مایع
• کروماتوگرافی تقسیمی
• کروماتوگرافی کاغذی
کروماتوگرافی گاز ـ مایع
• کروماتوگرافی گاز ـ مایع
• کروماتوگرافی ستون موئین
مزیت روشهای کروماتوگرافی
روشهای کروماتوگرافی میتوانند جداسازیهایی را که به روشهای دیگر خیلی مشکلاند، به انجام برسانند. زیرا اختلاف جزئی موجود در رفتار جزئی اجسام، در جریان عبور آنها از یک سیستمِ کروماتوگرافی چند برابر میشود.
هر چه این اختلاف بیشتر شود، قدرت جداسازی بیشتر و برای انجام جداسازی نیاز کمتری به وجود اختلافات دیگر خواهد بود.
• مزیت کروماتوگرافی نسبت به ستون تقطیر این است که بهآسانی میتوان به آن دست یافت. با وجود اینکه ممکن است چندین روز طول بکشد تا یک ستون تقطیر به حداکثر بازده خود برسد، ولی یک جداسازی کروماتوگرافی میتواند در عرض چند دقیقه یا چند ساعت انجام گیرد.
• یکی از مزایای برجستة روشهای کروماتوگرافی این است که آنها آرام هستند. به این معنی که احتمال تجزیة مواد جداشونده به وسیلة این روشها در مقایسه با سایر روشها کمتر است.
• مزیت دیگر روشهای کروماتوگرافی این است که تنها مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه لازم است. به این علت، روشهای تجزیهای مربوط به جداسازی کروماتوگرافی میتوانند در مقیاس میکرو و نیمه میکرو انجام گیرند.
• روشهای کروماتوگرافی ساده، سریع و وسایل مورد لزوم آنها ارزان هستند. اجزای مخلوطهای پیچیده را به کمک این روشها میتوان از یکدیگر جدا کرد.
مواد انواع کروماتوگرافی
مواد شیمیایی مشابه کروماتوگرافی تقسیمی
مواد شیمیایی غیر مشابه کروماتوگرافی جذب سطحی
گازها و اجسام فرّار کروماتوگرافی گازی
مواد یونی و معدنی کروماتوگرافی تبادل یونی در ستون
کروماتوگرافی کاغذی یا لایه نازک
مواد یونی و غیر یونی الکتروفوز ناحیهای
مواد زیستی و ترکیباتی با جرم مولکولی نسبی بالا کروماتوگرافی تبادل یون یا ژلی
انتخاب بهترین روش کروماتوگرافی
انتخاب نوع روش کروماتوگرافی بجز در موارد واضح (مانند کروماتوگرافی گازی در جداسازی گازها) عموماً تجربی است. زیرا هنوز هیچ راهی برای پیشبینی بهترین روش برای جداسازی اجسام، مگر در چند مورد ساده وجود ندارد.
در ابتدا روشهای سادهتری مانند کروماتوگرافی کاغذی و لایه نازک امتحان میشوند. در صورتی که با این روشها مستقیماً قادر به جداسازی باشند، جداسازی را باید به وسیلة آنها صورت داد. در غیر این صورت، از روشهای پیچیدهتر استفاده میشود.
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HELC)، وقتی که روشهای ساده فاقد کارایی لازم هستند، میتواند جوابگو باشد.



دیدگاه ها : نظرات
آخرین ویرایش: - -

دستگاه الکتروفورز

1390/08/30 11:39

نویسنده : شهرام قاسمی
ارسال شده در: تجهیزات پزشکی ، مقالات علمی آموزشی ،

الکتروفورز از شناخته شده ترین روش های آزمایشگاهی برای جداسازی بیومولکول ها است. این روش در سال ۱۸۰۷ توسط Reuss کشف شد. او مشاهده کرد که ذرات خاک رس تحت تاثیر میدان الکتریکی در آب پراکنده می شوند. به طور کلی الکتروفورز حرکت ذرات پراکنده در داخل مایعی تحت تاثیر یک میدان الکتریکی یکنواخت است. همین حرکت در فضایی با میدان الکتریکی غیر یکنواخت دی الکتروفورز نامیده می شود.


الکتروفورز بدین دلیل اتفاق می افتد که ذرات معلق در مایع معمولا دارای بار الکتریکی سطحی هستند و میدان الکتریکی نیروی کولونی الکترواستاتیک به این ذرات باردار اعمال می کند. اخیرا شبیه سازی های دینامیک مولکولی، نظریه ای بیان داشته اند مبنی بر اینکه برای انجام الکتروفورز حتما نباید ذرات بار سطحی داشته باشند و حتی ذرات خنثی نیز به علت ساختار مولکولی خاصی که آب به عنوان مایع واسط دارد، می توانند الکتروفورز شوند.

نیروی کولونی الکترواستاتیک اعمال شده به بار سطحی، با نیروهای مخالف الکترواستاتیک کاهش پیدا می کند. بر طبق تئوری لایه مضاعف، تمام سطوح بار دار در مایعات با لایه ای از بار مخالف پوشانده می شوند که از نظر مقداری کاملا برابر با بار سطحی است اما با علامت مخالف آن. میدان الکتریکی همانند بار سطحی به این لایه نیرو وارد می کند. مجموع این نیروها برابر است با اولین نیروی نامبرده، اما در جهت مخالف آن. در حقیقت این نیرو به یون های موجود در لایه ثانویه اعمال می شود. این یون ها در فاصله ای از سطح ذره قرار می گیرند و بخشی از این نیروی الکترواستاتیک را از طریق تنش برش سیال به سطح ذره منتقل می کنند این بخش از نیرو که به بدنه ذره وارد می شود، نیروی منفی الکتروفورتیک نامیده می شود.

یک نیروی الکتریکی دیگر نیز وجود دارد که مرتبط با انحراف لایه ثانویه است و مربوط به تقارن کروی و رسانایی سطح است و به سبب زیادی یون ها در لایه ثانویه به وجود می آید. این نیرو نیروی تخفیف الکتروفورتیک نامیده می شود.

تمام این نیروها با اصطکاک هیدرودینامیک، به تعادل می رسند و باعث حرکت ذرات در سیال می شود. سرعت این حرکت v، متناسب با شدت میدان الکتریکی E است (البته در صورتی که این میدان خیلی قوی نباشد.) ضریب این تناسب تحرک پذیری الکتروفورتیک است که رابطه بین شدت میدان الکتریکی و سرعت ذره را مشخص می نماید:

ماکرومولکول هایی مانند اسید نوکلئیک، DNA و پروتئین ها نیز باردار هستند و می توان با قرار دادن آن ها در یک میدان الکتریکی، بر مبنای خاصیت الکتروفورز آن ها را تفکیک کرد. سرعت حرکت مولکول ها در این شرایط نه تنها تحت تاثیر بار الکتریکی و شدت میدان الکتریکی است، بلکه عواملی نظیر اندازه، وزن مولکولی و شکل فضایی مولکول نیز در این امر دخیل هستند. همچنین اثرات محیطی نظیر نوع و نحوه استفاده از بافرها و حرارت ایجاد شده در حین کار نیز از عوامل موثر بر جداسازی مولکول های نمونه هستند. معمولا الکتروفورز برای تفکیک مولکول های بزرگی چون پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک به کار برده می شود، اما در مواردی نیز برای جداسازی مولکول های باردار کوچک تر نظیر قندها، اسیدهای آمینه، پپتیدها و حتی یون های ساده مورد استفاده قرار می گیرد.

در طی قرن ۲۰ میلادی چندین تئوری برای محاسبه این پارامتر به وجود آمده اند. که مهم ترین آن ها نظریه Smoluchowski در سال ۱۹۰۳ میلادی بود.

Arne Tiselius در سال ۱۹۴۸ به خاطر زحماتی که برای الکتروفورز و آنالیز جذبی کشید برنده جایزه نوبل شد و از این رو او را پدر الکتروفورز نامیدند. اولین الکتروفورز نیز الکتروفورز بدون مرز تیسلیوس نام داشت که به وسیله آن محلول های پروتئینی غلیظ را در یک تیوب U شکل بزرگ که به وسیله بافر پوشانده شده بود، مورد آزمایش قرار می دادند. این روش الکتروفورز بسیار مشکل بود، به همین دلیل در سال ۱۹۵۰ تغییراتی در عملکرد آن اعمال شد. ابتدا از فیلترهای کاغذی و استات سلولز استفاده می شد، اما به دلیل ظرفیت محدود و رزولوشن پایین این مواد، جای خود را به ژل دادند. ژل های استفاده شده در آن زمان به علت بزرگ بودن خلل و فرج ها قادر نبودند پروتئین ها را به تفکیک سایز جداسازی کنند، از این رو به تدریج به ژل هایی چون آگاروز دست یافتند.
امروزه الکتروفورز ژلی از بخش های جدا ناپذیر هر تحقیق و فعالیت های آزمایشگاهی به منظور جداسازی ماکرومولکول هااست. محدوده وسیعی از فعالیت های آزمایشگاهی تحقیقاتی و کلینیکی مانند تسلسل ژن ها، جداسازی کروموزوم ها، جداسازی و تعیین خصوصیات پروتئین ها توسط این روش انجام می گیرد. علاوه بر این، استفاده از الکتروفورز از مرز آزمایشگاه ها فراتر رفته و به عنوان شاهدی برای وکلا، قضات و هیات منصفه در امور قضایی محسوب می شود. تشخیص هویت DNA به خصوص در موارد تعویض نوزاد در بیمارستان ها و تعیین والدین فرد کاربرد بسیاری در علوم ژنتیک پیدا کرده است.

در حال حاضر آگاروز و پلی کریل آمید متداول ترین و پر کاربردترین ماده به عنوان واسط در الکتروفورز ژلی محسوب می شوند. در اغلب دستگاه های الکتروفورز، ژل مابین دو محفظه بافری قرار می گیرد به طوری که ژل تنها واسطه در عبور جریان الکتریسیته بین این دو محفظه باشد. هر دو شبکه خلل و فرج داری تولید می کنند که میکرومولکول هایی بارداری را که در پاسخ به میدان الکتریکی جابه جا می شوند در خود جای می دهند. به عنوان مثال زمانی که جریان اعمال می شود، DNA های با بار منفی به سمت الکترودهای باردار مثبت حرکت می کنند. خلل و فرج های موجود در شبکه ژلی انتقال مولکول های بزرگ را محدود می کنند و این در حالی است که مولکول های کوچک تر با آزادی بیشتری منتقل می شوند و در فاصله دورتری از الکترودها قرار می گیرند. این غربال مولکولی مولکول ها را بر مبنای سایزشان جدا می کند. همچنین می توان مولکول ها را بر مبنای بار اولیه ای که داشتند جداسازی کرد. مولکول هایی که بار بیشتری دارند تحرک الکتروفورزی بیشتری از خود نشان می دهند و سریع تر منتقل می شوند بدین ترتیب درون ژل با اولویت باری که داشتند قرار می گیرند. جداسازی بر مبنای بار به ژلی نیاز دارد که مانند آگاروز دارای خلل و فرج های بزرگ تری باشند. آگاروز برای جداسازی اسید نوکلئیک ها و پروتئین های خیلی بزرگ یا ترکیب ها استفاده می شود. آگاروز یک پلی ساکارید طبیعی است که از نوع خاصی جلبک دریایی قرمز به دست می آید. زمانی که گرما داده شده و سپس سرد می شود به صورت جامد متخلخلی با خلل و فرج های نسبتا بزرگ تبدیل می شود.

الکتروفورز ژل آگاروز (AGE) را می توان برای جداسازی مولکول ها بر مبنای بار یا وزن مولکولی شان استفاده کرد. یکی از مهم ترین کاربردهای AGE جداسازی بخش های حاصل از برش DNA با آنزیم های محدودکننده است.

در طی انجام الکتروفورز ثابت نگاه داشتن حرارت اهمیت بسیاری دارد چرا که به حفظ تکرار پذیری آزمایش کمک می کند. به عنوان مثال پلیمریزه شدن آکریل آمید یک واکنش گرمازا است و گرمای حاصله به خصوص در مورد ژل های غلیظ تر، ممکن است باعث بروز بی نظمی در اندازه ی منافذ ژل شود. انتقال گرما معمولا مشکلی در ژل هایی با غلظت کمتر از %۱۵ T ایجاد نمی کند. البته ممکن است بالا رفتن دما مشکلات دیگری چون شکستن شیشه های الکتروفورز و آسیب به دستگاه را منجر شود. پروتئین ها به علت خصوصیت آمفوتری خود تحت تاثیر pH محیط بارالکتریکی خاص خود را نشان می دهند. بدین علت در جداسازی توسط الکتروفورز باید pH محلول های مورد استفاده ثابت باقی بماند. از آنجا که الکترولیز آب در آند یون ای "H+" و در کاتود یون های "OH " ایجاد می کند، برای ثابت نگاه داشتن pH محلول های مورد استفاده، باید آن ها را بافر کرد.

نوع دیگری از الکتروفورز، الکتروفورز مویین (CE) است. این تکنیک که عمده ترین کاربرد آن در شیمی دارویی و درمانی است، برای جداسازی مولکول های درشت و ریز در مجاری بسیار نازک (با قطر داخلی ۲۰۰ ۲۰میکرومتر) استفاده می شود. در این روش، جداسازی با ولتاژ بالا kV) ۳۰ ۱۰) امکان پذیر می شود. از محاسن CE می توان به سرعت دستیابی به نتیجه در آنالیز یون ها اشاره کرد. به طور کلی CE بیشتر زمانی مطرح می شود که با آنالیت های باردار با پلاریته و قطبیت زیاد سر و کار داریم. این تکنولوژی در علوم بایوتکنولوژی جایگاه ویژه ای پیدا کرده و در آنالیز ماکرومولکول هایی چون پروتئین ها و کربوهیدرات ها جایگزین خوبی برای الکتروفورز سنتی به شمار می رود. همچنین تکنولوژی CE برای سرعت بخشی به رشد علم ژنتیک به خدمت گرفته شده است. استفاده از الکتروفورز موئین در علوم تحلیلی به خصوص در زمینه دارویی و زهر شناسی رشد بسیاری داشته است.

الکتروفورز موئین در بر گیرنده چندین تکنیک است که عملکرد و مشخصه های متفاوتی با هم دارند. این تکنیک ها که به مودهای الکتروفورز موئین معروف هستند عبارتند از: الکتروفورز ناحیه ای موئین (CZE) ، تمرکز ایزوالکتریک (IEF)، الکتروفورز موئین ژلی، ایزوتاکوفورز (ITP) و کروماتوگرافی الکتروسینتیک موئین.

نوع دیگری از الکتروفورز که قدیمی ترین نوع این تکنیک محسوب می شود، الکتروفورز سطحی نام دارد. در این روش از یک لایه کاغذی متخلخلی با طول ۱۰ ۲۰ سانتیمتر، ترموپلاستیکی متشکل از سلولز و اسید استیک و ژل پلیمر استفاده می شود.

تشخیص هویت DNA به وسیله الکتروفورز، اندازه گیری هر رشته و شمارش تعداد بخش ها و برش های تکرار شده در آن است. دانشمندان برای این کار از روش الکتروفورز ژلی استفاده می کنند. بدین ترتیب که با جریان الکتریکی رشته های DNA را از میان ژل عبور می دهند. چون هر بیت از DNA دارای بار منفی است و در معرض نیروی الکتریکی با بار برابر قرار می گیرد و آن را به سمت وجهی از ژل که بار مثبت دارد، پیش می برد. ذرات کوچک تر سریع تر حرکت می کنند. وقتی جریان برداشته می شود، از ژل تصویری گرفته می شود تا مشخص شود هر بیت چه قدر جابه جا شده است. با مقایسه باندهای ایجاد شده با نمونه های استاندارد که سایزهای شناخته شده ای دارند، طول هر بخش از DNA به دقت اندازه گیری می شود.

 




دیدگاه ها : نظرات
آخرین ویرایش: - -



تعداد کل صفحات : 38 ... 5 6 7 8 9 10 11 ...
Check Google Page Rank

تصویر ثابت